Utilité clinique de la réaction en chaîne de l’eschar polymérase pour le diagnostic du Typhus Scrub: une étude prospective

Contexte Le but de cette étude était de déterminer l’utilité diagnostique d’effectuer une PCR en chaîne pour le diagnostic du typhus de scrub grâce à une comparaison prospective des résultats de PCR avec un test d’immunofluorescence indirecte. Résultats de l’IFA Méthodes Nous avons mené une étude prospective multicentrique impliquant des patients gommage du typhus Des échantillons de sang total et des escarres ont été prélevés pour l’évaluation sérologique et la PCR Une nouvelle croûte s’est formée plusieurs jours plus tard sur le site de l’escarre prélevée. , si possible, tous les mois après un traitement antibiotique. Résultats Nous avons étudié prospectivement les patients avec un éventuel typhus exfoliant. Sur ces patients, le typhus de brousse a été confirmé sur la base d’un seul titre d’immunoglobuline M immunofluorescence indirecte contre Orientia tsutsugamushi de ⩾: ou Multiplication par in Le titrage de suivi des escarres a montré une sensibilité de% intervalle de confiance, – et une spécificité de% intervalle de confiance, – Parmi les patients qui ont montré des résultats positifs de PCR eschar à l’admission,% ont également montré des résultats positifs Conclusions Le test PCR eschar a été utile comme test rapide et fiable pour confirmer le diagnostic de typhus exfoliant, même si les patients ont reçu un traitement avec des antibiotiques appropriés, tels que des macrolides. , les quinolones et la tétracycline, qui sont tous actifs contre les espèces Orientia et Rickettsia

Le typhus exfoliant est une maladie fébrile aiguë caractérisée par une forte fièvre, des éruptions cutanées et des maux de tête. Il est causé par la bactérie Gram négatif intracellulaire Orientia tsutsugamushi C’est une maladie fébrile majeure en Corée, au Japon, en Chine et en Asie du Sud. Pays pendant la saison automnale Le principal réservoir de typhus exfoliant est les rongeurs, et leurs acariens agissent à la fois comme réservoir et vecteur. L’infection survient lorsque les larves des chiggers à acariens thrombiculés infectés par O tsutsugamushi piquent et sucent le liquide des tissus humains. sur le site de la morsure de chigger, et au moment de la formation d’une telle escarre, on observe l’apparition d’une éruption maculo-papuleuse, de fièvre, de myalgie, d’anorexie et d’hypertrophie des ganglions lymphatiques. le diagnostic de la sharka de rickettsiose ou du typhus de brousse Le test de PCR nichée a été étudié sur la couche leucocytaire du sang contre O tsutsugamushi comme étant une méthode de test sensible et spécifique [ ] Nous avons précédemment rapporté un cas dans lequel le diagnostic a été fait en effectuant une PCR sur l’escarre du patient, et nous avons également suggéré que la PCR escarre pourrait être un test diagnostique utile pour les patients atteints de typhus exfoliant qui recevaient un traitement antibiotique approprié. Pour examiner l’utilité clinique d’effectuer une PCR nichée avec une escarre comme méthode de diagnostic, nous avons mené une étude comparative de l’étalon-or, c’est-à-dire un dosage d’anticorps immunofluorescent IFA- et escarres PCR pour les patients soupçonnés d’être atteints de typhus exfoliant dans des établissements médicaux de la région sud-ouest de la Corée

Patients et méthodes

tuteurs Chaque patient a été admis à l’hôpital universitaire de Chosun ou de ses hôpitaux communautaires Haenam General Hospital, Jangheung Hospital et Muan Hospital, tous situés dans la partie sud-ouest de la Corée, de septembre à décembre. Les patients participant à l’étude ont été soigneusement examinés pour la présence ou l’absence d’escarres, et lorsqu’une escarre a été détectée, une partie de l’escarre a été prélevée après consentement du patient. Dans les cas où les escarres s’étaient déjà détachées avant la visite, la zone escarre était frottée avec un coton-tige mouillé avec une solution saline, et ce tampon a été utilisé pour PCR Un cas défini de typhus exfoliant a été défini par un titre d’immunofluorescence indirecte IgM contre O tsutsugamushi de ⩾: ou par une augmentation de ⩾ fois du titre de suivi Pour le dosage PCR des échantillons de sang total, des escarres et des échantillons prélevés au moyen de cotons-tiges ont été utilisés. Plusieurs jours après la collecte de l’escarre, de nouvelles escarres ont été formées dans la zone d’extraction des escarres. et pour les patients qui nous ont donné la permission, des tests d’anticorps et de PCR ont été effectués en utilisant le sang et les escarres nouvellement formées tous les mois après un traitement. L’IFA et la PCR nichée ont été réalisées au Centre coréen de contrôle et de prévention des maladies. la nature en double aveugle de l’enquête, le personnel qui a effectué ces essais n’avait aucune connaissance de l’information clinique et des diagnostics définitifs, et les médecins ne connaissaient pas les résultats de PCR et d’IFA Pour les patients participant à l’étude, Le typhus murin, la leptospirose, la fièvre hémorragique avec syndrome rénal, et le lupus érythémateux disséminé. Cette étude a été réalisée après approbation du comité d’éthique pour la recherche humaine de l’hôpital universitaire de Chosun. et les eschars des patients avec l’utilisation du QIAamp ADN minikit Qiagen Nested PCR test était pe Les amorces nucléotidiques sont basées sur la séquence nucléotidique codant pour l’antigène de la protéine de paroi principale -kDa de l’espèce O tsutsugamushi Gilliam Les amorces ‘-TCAAGCTTATTGCTAGTGCAATGTCTGC-‘ et ‘-AGGGATCCCTGCTGCTGTGCTTGCTGCG-‘ ont été utilisés pour la première PCR, et les amorces de PCR nichées ‘-GATCAAGCTTCCTCAGCCTACTATAATGCC-‘ et ‘-CTAGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC-‘ ont été utilisées pour la deuxième PCR La première étape PCR a été réalisée avec μL d’ADN extrait de la couche leucocytaire ou Le mélange d’amplification PCR dans un volume final de μL contenait mmol / L MgCl, mmol / L KCl, mmol / L Tris-HCl pH, μmol / L de désoxynucléoside triphosphates, et U de -μmol / L Taq ADN polymérase TAKARA La quantité de l’amorce ajoutée aux mélanges réactionnels était de μmol / L pour la première étape et de μmol / L pour la deuxième étape. Les réactions ont été effectuées pour les cycles de la première et de la deuxième amplification. Les conditions de lification étaient l’activation initiale de la polymérase à ° C pendant min, suivie de cycles à ° C pendant s, ° C pendant min, et ° C pendant min, et une étape d’élongation finale a été faite à ° C pendant min avec l’utilisation d’un ADN Recherche sur le cycleur thermique Peltier MJ Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur un gel d’agarose%; Les sérotypes standard de O tsutsugamushi Gilliam [ATCC VR], Karp [ATCC VR] et Kato [ATCC VR] et le sérotype épidémique trouvé en Corée Boryong ont été observés sous contrôle transilluminateur UV. L’eau distillée et les cellules L ont été utilisées comme contrôles négatifs Lorsqu’une bande spécifique au bp a été détectée, l’échantillon a été considéré comme ayant un résultat positif Pour éviter la contamination croisée, nous avons observé les réglementations strictes recommandées pour les expériences de diagnostic PCR. En utilisant le sérum des patients et par la méthode décrite par Robinson et al, avec quelques modifications, les anticorps IgM et IgG dirigés contre l’antigène O tsutsugamushi standard Gilliam, Karp, Kato et Boryong ont été évalués En bref, le sérum a été dilué: avec du PBS, et la solution diluée en série a été déposée sur les lames, sur lesquelles l’antigène Orientia a été étalé. Les sérums qui étaient déjà connus pour avoir un résultat positif ou négatif ont été utilisé comme contrôle de qualité interne pour les expériences Les lames expérimentales ont été incubées dans une chambre humidifiée à ° C pendant min et ont ensuite été lavées avec du PBS et de l’eau distillée IgG et IgG anti-humaine de chèvre conjuguées avec des marqueurs fluorescents et diluées: avec du PBS à chaque diapositive; ces lames ont été laissées à incuber puis ont été lavées comme décrit ci-dessus. Les lames ont été séchées à l’air et ensuite montées en utilisant la solution de montage FAacto. Elles ont été observées sous un microscope à immunofluorescence Axioskop; Carl Zeiss à un grossissement x Les titres les plus élevés des souches obtenues par l’IFA, c’est-à-dire les souches Gilliam, Karp, Kato et Boryong, ont été utilisés comme résultats de titrage.

Résultats

Données cliniques Un total de patients a été inclus dans cette étude. Parmi ces patients, le typhus exfoliant a été confirmé sur la base soit d’un seul titre d’IgM immunofluorescence indirecte contre ts tsutsugamushi de ⩾: soit d’une ⩾⩾ fois le titre de suivi. Les patients ont eu des diagnostics différents: patients atteints de leptospirose, patients atteints de syndrome rénal, patients atteints de syndrome rénal, patients atteints de lupus érythémateux disséminé, patients atteints de réactions médicamenteuses et patients inconnus. Les résultats des tests IgM étaient négatifs ou parce qu’il y avait un échec à démontrer une augmentation ⩾ fois de leurs titres en raison de la perte de suivi. Des escarres ont été observées pour% des patients qui avaient un diagnostic définitif et pour les patients avec un diagnostic non confirmé. escarres chez les patients avec confirmée typhus exfoliant ont été trouvés dans les patients des membres inférieurs, l’aisselle , la poitrine, les membres supérieurs, l’abdomen, la région inguinale, le dos, l’épaule et la tête et le cou Eschar PCR comme une méthode de diagnostic pour le typhus exfoliant Au moment de l’admission, eschars pourrait être détecté chez les patients typhus exsudatif confirmé Pour les patients, une PCR nichée utilisant une escarre a été réalisée, et% d’entre eux ont montré un résultat positif pour l’escarre PCR Parmi les patients ayant reçu un diagnostic de typhus exanthématique, une lésion détectée était suspectée eschar; Par conséquent, la PCR escarre a été réalisée et la PCR réalisée sur la couche leucocyto-plaquettaire de ce patient a également montré un résultat négatif. Sur le test de suivi IFA de ce patient, les anticorps IgM et IgG n’ont pas été détectés. avait une sensibilité de% et une spécificité de% Pour les patients qui n’avaient pas confirmé le typhus exfoliant, les escarres ont été détectées, et le test ACP eschar a montré des résultats positifs pour tous. D’autre part, les résultats du test PCR nichent les couches ont démontré une sensibilité de% CI, -, une spécificité de% CI, -, une valeur prédictive positive de% CI, -, et une valeur prédictive négative de% CI, -Durée des résultats positifs pour l’eschar PCR Pour% des les patients qui ont reçu un diagnostic définitif par l’IFA, les escarres ont pu être détectés, et la PCR nichée des escarres a été réalisée pour les patients; % avaient des résultats d’ACP positifs Parmi les patients qui avaient un résultat PCR positif à l’escarre, des PCR d’escarre de suivi de semaine ont été réalisés après un traitement avec des antibiotiques; % d’entre eux ont eu un résultat positif pour PCR escarre, et ont eu un résultat négatif Eschar PCR a été réalisée à nouveau après une semaine pour les patients qui avaient un résultat PCR positif sur le suivi de la semaine sur ce second suivi, patients% avait un résultat positif à la PCR, et seul le patient avait un résultat négatif

Discussion

Une escarre d’environ – mm de diamètre est formée sur les patients affectés par le typhus exfoliant au site mordu par un chigger, ce qui pourrait être considéré comme le résultat clinique le plus important pour le diagnostic du typhus de brousse. , suivie d’un ulcère bulleux, qui est recouvert d’une escarre noire, et le voisinage de l’escarre est entouré d’un gonflement rouge Une escarre typique est formé au moment où le patient présente des symptômes cliniques Dans le passé, le diagnostic clinique du typhus exfoliant a été réalisé sur la base de l’évaluation des escarres, des éruptions cutanées et des antécédents d’activité de plein air du patient Cependant, dans le contexte clinique actuel, on observe des cas sans éruption et accompagnés seulement d’escarres. A propos d’un patient pyrétique avec une lésion similaire à l’escarre, le médecin doit déterminer si une telle lésion est similaire aux croûtes qui couvrent les plaies simples ou si une escarre est présente [, -] Il est possible confirmer si la cause d’une lésion ressemblant à une escarre est de traiter le typhus ou non seulement en évaluant le titre de l’anticorps sérique contre O tsutsugamushi en effectuant des tests sérologiques pendant la phase aiguë et de récupération ou en isolant O tsutsugamushi des cellules cultivées ou infectées. souris Néanmoins, le diagnostic définitif peut prendre de quelques jours à quelques semaines. Par conséquent, étant donné que l’escarre est la zone où O tsutsugamushi prolifère, une grande quantité d’Orientia devrait y être présente; en outre, une escarre est un échantillon diagnostique qui peut être collecté facilement. Ainsi, nous avons tenté des tests PCR d’escarre pour le diagnostic du typhus exfoliant. Les résultats de PCR et d’IFA ont été comparés entre les escarres ou avec des lésions similaires aux escarres. après les résultats de l’IFA, qui est la méthode de diagnostic définitif, et les résultats de la PCR nichée réalisée sur eschar ont été comparés, la sensibilité de la PCR était de%, et la spécificité était de% Il a été vérifié que ceux-ci étaient similaires spécificité de la PCR réalisée sur la couche leuco-plaquettaire, rapportée par ailleurs Parmi les patients n’ayant pas confirmé le typhus, des escarres ont été détectées, et ces patients ont eu un résultat positif pour l’escarre PCR Parmi les patients ayant une escarre positive Les résultats de PCR,% ont également eu des résultats positifs pour la PCR réalisée sur l’escarre nouvellement formée après le traitement avec des antibiotiques, et cela a été confirmé pour être une valeur plus élevée que le taux positif de% o f qui a été détectée par PCR de la couche leucocytaire de la semaine du sang après l’administration d’antibiotiques Une telle continuité de la positivité pour la PCR escarre après le traitement antibiotique a été maintenue chez les patients quelques semaines après l’administration des antibiotiques. buffy coat PCR pendant la période de récupération, l’ADN d’Orientia dans le sang des patients est facilement éliminé à la suite de l’administration appropriée de l’antibiotique Néanmoins, une escarre est le site d’infection de O tsutsugamushi, et une grande quantité d’inoculation bactérienne y est présente, Ainsi, nous avons confirmé que, même si les patients atteints de typhus exfoliant ont reçu un traitement avec des antibiotiques appropriés, la méthode PCR eschar pourrait être appliquée comme une méthode efficace pour le diagnostic du typhus exfoliant. une telle PCR pourrait être disponible dans quelques heures, et cela pourrait être d’une grande aide dans le diagnostic rapide et le traitement de ces p Dans notre cohorte, parmi les patients chez qui le typhus exanthématique a été confirmé, un patient présentait de la fièvre, des éruptions cutanées et une croûte semblable à l’escarre. Ce patient a reçu un diagnostic erroné de typhus exfoliant et a reçu une doxycycline. ce patient, les résultats ont été négatifs, et l’état du patient a finalement été confirmé en tant que lupus érythémateux systémique. En outre, pendant la période de notre enquête, eschar PCR a été réalisée pour les patients qui ont visité notre hôpital avec de la fièvre et une croûte similaire. n’ont pas répondu aux critères d’inclusion, ils ont signalé de la fièvre mais n’ont pas signalé de symptômes tels que maux de tête, malaise, myalgie, toux, nausées et gêne abdominale. Il a été confirmé qu’un patient avait une pyélonéphrite et l’autre une pneumonie sildenafil. La PCR était négative On a trouvé que leurs croûtes, qui étaient semblables aux escarres, étaient de simples croûtes formées après un traumatisme et des croûtes après des moustiques. morsures, respectivement figure Nous avons trouvé que l’escarre n’est pas toujours une constatation pathognomique du typhus exfoliant

Figure Vue largeTélécharger la lameDifférentes escarres et une escarre ressemblant à une escarre Une gale après un traumatisme sur la jambe inférieure gauche d’un patient avec une pneumonie ressemble à une escarre Diverses escarres de typhus exfoliant ont été confirmées en utilisant la PCR nested et immunofluorescence b-dFigure View largeTélécharger slideVarious Une escarre après un traumatisme sur la jambe inférieure gauche d’un patient avec une pneumonie ressemble à une escarre Diverses escarres de typhus exfoliant ont été confirmés en utilisant la PCR nichée et l’anticorps immunofluorescent b-dIn conclusion, il a été prouvé que, Au cours d’une épidémie de typhus exfoliant, la réalisation de PCR nichée sur les escarres est utile pour le diagnostic précoce du typhus exfoliant pendant la phase aiguë chez les patients présentant une fièvre et une éruption cutanée, même si les patients avaient reçu des antibiotiques actifs contre Orientia et Rickettsia. espèces, tels que les macrolides, les quinolones et la tétracycline Cette nouvelle méthode a été confirmée très utile pour distinguishi ng si une croûte est un gommage typhus eschar

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits