Étiqueté Ligand Displacement: Extension du criblage RMN des cibles protéiques

Au cours des dernières décennies, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est devenue un outil puissant pour l’étude des molécules et des systèmes biologiques.1 La détermination de la structure de petites protéines et de bonnes protéines les polynucléotides en solution utilisant la RMN sont devenus routiniers. Pour compléter cette information structurelle, la spectroscopie RMN peut également fournir des informations sur la dynamique moléculaire de ces macromolécules.2 Cependant, sa contribution la plus importante, en particulier dans le domaine de la recherche pharmaceutique, pourrait être la capacité de la spectroscopie RMN à fournir des informations sur les interactions moléculaires. le niveau atomique. Cette information comprend, en premier lieu, la détermination si oui ou non une petite molécule particulière se lie à une protéine d’intérêt. Deuxièmement, si la molécule se lie, quels atomes de la petite molécule et de la protéine sont impliqués dans cette interaction? Différentes techniques basées sur la RMN ont été développées pour répondre à ces deux points. Ces méthodes fournissent des niveaux de détail variés et ont été atteintes avec plus ou moins de succès.3 Une des premières de ces techniques à être développée était la relation d’activité par RMN ” première méthode à être réellement appliquée dans un mode de dépistage, c’est-à-dire tester des milliers de petites molécules pour se lier à une cible protéique.4 Depuis la publication initiale décrivant le SAR par RMN, l’utilisation de la RMN dans la découverte et l’optimisation des industrie pharmaceutique. Plus particulièrement, SAR par RMN a joué un rôle essentiel dans la découverte des molécules pro-apoptotiques ABT-737 et ABT-263, dont la dernière est actuellement testée cliniquement comme agent anticancéreux.5SAR par RMN est une méthode basée sur la cible où le déplacement chimique des résonances protéiques, à partir des amides du squelette ou des groupes méthyle de la chaîne latérale, est surveillé lorsque la protéine est interrogée avec une seule petite molécule ou un mélange de petites molécules. Bien que l’approche continue d’être la méthode la plus robuste et la plus fiable pour le criblage par RMN de cibles protéiques, elle présente plusieurs inconvénients. L’une des principales limites de la RSR traditionnelle par RMN est la taille des protéines. Lorsque la taille d’une protéine augmente, son temps de corrélation rotationnelle diminue, et par la suite, la largeur de la ligne de résonance augmente. Le spectre de cohérence quantique hétéronucléaire unique (HSQC) sur lequel cette méthode est basée non seulement devient plus encombré en raison d’un plus grand nombre de résonances, mais les résonances individuelles deviennent plus larges jusqu’à ce que le spectre ne soit plus interprétable. En utilisant cette méthode, la limite supérieure réaliste pour la masse moléculaire de la protéine est d’environ 50 kDa. En outre, l’agrégation des protéines peut rapidement dégrader la qualité du spectre HSQC indépendamment de la taille de la protéine et peut être un obstacle majeur à la SAR par la méthode RMN. Enfin, le SAR par RMN nécessite des protéines isotopiquement marquées (15N ou 13C), ce qui, dans de nombreux cas, peut être difficile à obtenir. À la lumière de ces limitations, d’autres méthodes basées sur la RMN ont été développées. changement d’une propriété de ligand spécifique lors de la liaison à une protéine cible. Ces méthodes à base de ligands comprennent la spectroscopie de différence de transfert de saturation (STD), 6 waterLOGSY, 7 SLAPSTIC, 8 TINS, 9 FAXS, 10 méthodes de compétition directe unidimensionnelle, 11 et autres.3 Malheureusement, les méthodes basées sur les ligands souffrent également de diverses limitations , dont la plus commune est l’interférence de la liaison non spécifique d’une petite molécule à une protéine cible et le chevauchement de résonance dans les spectres unidimensionnels qui sont typiquement enregistrés pour ces méthodes à base de ligand. La seule exception à cette règle est la méthode FAXS basée sur le fluor. Par conséquent, il existe un besoin d’une méthode basée sur un ligand améliorée et plus fiable qui surmonte ces limitations et peut être exécutée en utilisant la technologie standard à triple résonance. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode basée sur un ligand que nous avons appelée “ déplacement du ligand ” (LLD), qui est basée sur le déplacement d’un ligand marqué par un isotope (13C) à partir d’une cible protéique d’intérêt lors de l’addition d’un composé individuel ou d’un mélange de composés. La méthode n’est pas limitée par la taille de la protéine, elle est moins sensible à la liaison non spécifique du composé que d’autres méthodes à base de ligands, et ne nécessite pas de préparation de la protéine marquée isotopiquement. Il se compare favorablement à STD, la méthode basée sur le ligand la plus largement utilisée, et offre certains avantages distincts. Enfin, LLD peut être mis en œuvre avec des technologies RMN standard, y compris des sondes triples à résonance standard, et augmenter considérablement le nombre de cibles protéiques pour lesquelles le criblage basé sur RMN, en particulier le criblage de fragments, peut être appliqué. la cible protéique peut être traitée en termes d’échange simple à deux sites entre des espèces libres et liées.Pour un ligand qui est dans le régime d’échange rapide à intermédiaire avec une cible protéique, la contribution d’élargissement d’échange à la largeur de la raie de résonance à mi-hauteur est donnée par: où τ A est la durée de vie du ligand. Deux facteurs affectant cette durée de vie liée sont l’affinité inhérente du ligand pour la protéine, qui peut être exprimée comme une constante de dissociation, KD (égale au rapport de kon à koff), et le rapport de la protéine au ligand en solution. Ainsi, pour un ligand ayant une affinité donnée pour sa cible protéique, il existe un rapport de protéine à ligand, qui peut être déterminé empiriquement, où cette contribution d’élargissement d’échange sera maximale. Cet effet d’élargissement d’échange pourrait, en principe, , être utilisé soit directement ou en mode compétition, un peu comme STD, pour surveiller la liaison du ligand à une protéine. Pour observer directement la liaison d’un ligand à une protéine, le ligand doit avoir au moins une résonance qui ne chevauche pas les signaux de la protéine ajoutée. Cependant, pour la plupart des ligands, c’est probablement l’exception plutôt que la règle. De même, pour être utilisé dans un mode compétition, le “ probe ” la molécule doit avoir au moins une résonance qui ne chevauche pas les signaux de la protéine ou avec les signaux des lieurs potentiels. Ce chevauchement empêcherait probablement le criblage de mélanges.Ce dilemme est illustré sur la figure 22 pour la liaison du composé 1 (figure 1) (figure 1) au domaine ATPase de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90). ) .12 Hsp90 est une protéine chaperon moléculaire intracellulaire qui se compose de trois domaines et est largement exprimée dans diverses cellules.13 Le ciblage du domaine ATPase amino-terminal (MW ∼ 28 kDa) dans les cellules cancéreuses par diverses molécules a été montré Figure 2A2A montre la région aromatique d’un spectre de protons unidimensionnel du composé 1 en solution. Ce composé se lie au domaine ATPase de Hsp90 avec une constante d’inhibition (Ki) de 14 μ M tel que déterminé dans un test de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (TR-FRET) .12 Comme le montre la figure   ; D, 2B − D, l’addition de quantités croissantes de protéines provoque l’élargissement des signaux du ligand. Cependant, il est pratiquement impossible de surveiller cet élargissement à des concentrations plus élevées de protéines en raison du chevauchement de résonance avec les signaux de la protéine elle-même. Figure 1Effet de l’augmentation de la concentration en protéines (Hsp90, domaine ATPase) sur les résonances aromatiques de composé 1 (20 pM) dans un spectre RMN du proton. (A) Aucune protéine, (B) 5 μ protéine M, (C) 10 μ protéine M, et (D) 30 μ protéine M.Pour surmonter cette limitation, une version du composé 1 , qui contient un cycle phényle uniformément marqué au 13C, a été préparé par couplage de la 4-chloro-6-méthylpyrimidin-2-amine avec de l’acide phénylboronique marqué au 13C6 (information de support). Figure ​ La figure 3A3A montre un spectre de protons 13C-sélectionné unidimensionnel du ligand marqué au 13C dans le tampon seul. Ce spectre est essentiellement la première tranche d’un spectre 13C-HSQC. Dans les panneaux B Ȣ D est montré l’effet de l’augmentation des concentrations du domaine ATPase non marqué de Hsp90 sur les résonances du ligand. Contrairement au cas du ligand non marqué, on peut clairement voir qu’à un rapport molaire 1: 1 de la protéine au ligand, les résonances du ligand sont complètement élargies (figure 3C) .3C). Lors de l’addition d’un ligand concurrent (composé 3, Ki ∼ 11 μ M), les signaux provenant de la sonde marquée sont récupérés d’une manière dépendante de la dose (Figure 3E − G). 3E et # x02212; G). Dans les spectres F et G, où le composé 3 est à 200 et 400 ° M, respectivement, de petits signaux supplémentaires apparaissent à environ 7,5 et 8,0 ppm à partir de l’abondance naturelle de 1,1% de 13C dans le composé 3. Figure 3 (A &#x02212 D) Effet de l’augmentation de la concentration en protéine (Hsp90, domaine ATPase) sur les résonances aromatiques du composé 2 (20 μ M) dans un spectre RMN du proton sélectionné au 13C. (A) Aucune protéine, (B) 10 μ protéine M, (C) 20 μ protéine M, et … Une autre illustration de l’utilité de l’étiquetage isotopique pour surveiller proprement l’élargissement d’échange est montré pour le la liaison du 4-fluorobenzènesulonamide marqué au 13C (composé 4, figure ​ figure 1) 1) à l’anhydrase carbonique bovine. Les anhydrases carboniques sont des enzymes omniprésentes qui catalysent la conversion du dioxyde de carbone en ion bicarbonate et jouent un rôle important dans divers processus physiologiques, notamment la respiration et certaines réactions biosynthétiques.15 L’anhydrase carbonique bovine est une protéine de 30 kDa inhibée par divers sulfonamide ligands à base de En utilisant la résonance plasmonique de surface, l’affinité d’une version non marquée du composé 4 s’est révélée être d’environ 1% pour l’anhydrase carbonique bovine.16 Le composé 4 a été préparé en traitant uniformément le chlorure de 4-fluorosulfonyle marqué au 13C avec de l’ammoniac dans du méthanol. Information).La figure 44 illustre la réduction de l’intensité des résonances aromatiques du ligand en réponse à l’augmentation de la concentration en protéines. A un rapport molaire de protéine à ligand de 2: 1, les résonances du ligand libre se sont complètement élargies. Les deux signaux larges dans le spectre D proviennent vraisemblablement du ligand lié. Comme indiqué pour le domaine Hsp90, ATPase, l’addition d’un ligand concurrent (composé 5, Ki ∼ 48 pM) entraîne la récupération des signaux de la sonde. En plus d’utiliser des petites molécules spécifiquement conçues et marquées comme sondes, l’effet d’élargissement peut également être observé pour la liaison de produits naturels, tels que des nucléotides et des peptides, à des protéines (Information complémentaire, Figures 1S et 2S) .17,18Figure 4 ( D) Effet de l’augmentation de la concentration en protéine (anhydrase carbonique) sur le spectre RMN du proton sélectionné au 13C du composé 4 (20 μ M). (A) Aucune protéine, (B) 10 μ M anhydrase carbonique, (C) 20 μ M anhydrase carbonique, et (D) 40 … Outre le criblage des composés individuels, LLD peut être utilisé pour cribler des mélanges de composés contre une cible protéique. Figure ​ La figure 5A5A montre un spectre du Hsp90, domaine ATPase plus sonde (composé 2). Dans le spectre B, un mélange de neuf composés (10 & spplus sur la figure 1), qui ne se lient pas à la protéine, a été ajouté. Ces ligands ne montrent aucune perturbation des résonances de protéine 13C-méthyle dans un spectre de 13C-HSQC lorsqu’elles sont ajoutées à un excès molaire d’environ 10 fois. Comme on peut le voir, aucune récupération des signaux de sonde n’est observée. Les grands signaux de fond qui apparaissent entre 7,2 et 8,0 ppm proviennent de l’abondance naturelle de 1,1% de 13C dans ces ligands, qui sont chacun de 200 μ M. Lors de l’addition de 200 μ M composé 6 (Ki ∼ 5 μ M), suffisamment de signal de sonde est récupéré au-dessus du fond que ce composé pourrait clairement être signalé comme un liant.Figure 5LLD méthode appliquée au dépistage mélanges. (A) Spectre de référence de Hsp90, domaine ATPase plus sonde (30 μ protéine M et 20 μ M composé 2). (B) Plus mélange de neuf composés (10 − 18), à 200 μ M chacun, qui ne se lient pas à … De toutes les méthodes de criblage à base de ligand utilisant RMN, la spectroscopie STD continue d’être la méthode à base de ligands la plus largement appliquée. Il a été utilisé à la fois en mode direct et en mode compétitif et a été utilisé non seulement pour identifier les ligands protéiques mais aussi pour cartographier les épitopes de liaison des ligands liés aux protéines.6,19 La base de l’expérience STD-RMN est le transfert d’aimantation une protéine à un ligand lié. Bien qu’il s’agisse d’un outil très simple et polyvalent pour l’analyse des interactions protéine / ligand, il souffre de quelques inconvénients significatifs, parmi lesquels l’interférence de la liaison non spécifique et le chevauchement des signaux.Figure ​ Figure ​ Figure3E − G3E − G mais réalisées en mode STD. Dans la figure 6A6A, la région aromatique du spectre STD pour le composé 1 lié au domaine Hsp90, ATPase. Le rapport ligand-protéine dans ce cas est de 10: 1, ce qui est typique pour une expérience de compétition STD. Les spectres B et D montrent l’effet de l’addition de quantités croissantes d’un ligand concurrent, composé 3. Avec le composé 3 à 100 ° M (spectre B), il y a une nette diminution du signal STD. Cependant, à mesure que du composé supplémentaire est ajouté, il n’y a plus de diminution du signal STD (spectres C et D). Nous l’avons observé avec plusieurs autres systèmes dans notre laboratoire et l’avons attribué à une interaction non spécifique de la molécule sonde STD avec la protéine. Cette liaison non spécifique donne lieu à un certain “ fond ” Signal STD, qui reste même après addition supplémentaire de ligand concurrent. La figure 66 illustre également le deuxième inconvénient de la méthode de compétition STD − qui est le chevauchement potentiel de signaux provenant d’un ligand concurrent avec les signaux provenant de la molécule sonde STD. Dans ce cas particulier, il n’y a qu’un léger chevauchement d’une résonance provenant du composé ajouté 3 (∼ 7,59 ppm) avec une résonance provenant de la sonde. Cependant, il ressort clairement de cette figure que le chevauchement des résonances pourrait être un inconvénient sérieux, en particulier pour le criblage de mélanges de composés. Idéalement, on peut choisir une sonde avec une résonance bien éloignée des signaux des lieurs potentiels, mais cela n’est pas toujours possible.Figure 6STD − spectres de compétition pour le domaine Hsp90, ATPase. (A) Spectre STD de la molécule sonde (composé 1) à 100 μ M en présence de 10 μ protéine M, (B) plus 100 μ M composé 3, (C) plus 200 μ M composé 3, et (D) plus … Le chevauchement de résonance est aussi un inconvénient potentiel de la méthode de compétition unidimensionnelle décrite par Siriwardena et al.11 Dans cette méthode, l’intensité d’une molécule sonde non marquée en présence de sa cible protéique est surveillée à mesure que des liants potentiels sont ajoutés.Comme avec STD, une molécule sonde doit être trouvée dont les signaux RMN ne chevauchent pas ceux de la sonde, une limite qui est surmontée avec la méthode LLD. En choisissant le ligand marqué au 13C (sonde) pour une expérience LLD, deux facteurs ont besoin à prendre en considération. Le premier est l’affinité de la sonde pour la protéine. Dans notre expérience, les molécules sondes devraient idéalement avoir une affinité comprise entre 1 et 100 μ M. Pour les sondes qui se lient plus faiblement, un excès important de protéines peut être nécessaire pour observer un élargissement suffisant de l’échange. En revanche, il peut être difficile de concurrencer une molécule sonde qui se lie trop étroitement à sa cible protéique, en particulier avec des fragments faiblement liants. Le second facteur à considérer est la facilité avec laquelle une molécule sonde isotopiquement marquée peut être obtenue. Les acides aminés, peptides et nucléotides marqués de manière isotopique sont, en général, facilement obtenus à partir de sources commerciales. Les ligands synthétiques présentent plus de difficultés, car les matériaux de départ appropriés marqués par des isotopes doivent être trouvés. Cependant, comme seule une partie d’un ligand synthétique doit être marquée, c’est-à-dire une fraction phényle unique ou un groupe méthyle, pour que la molécule fonctionne comme une sonde, cet aspect de la méthode n’est pas aussi limitatif que possible. Le criblage d’une cible protéique pour des liants potentiels est effectué en préparant tout d’abord une solution mère de la sonde marquée isotopiquement et de la protéine non marquée au rapport protéine à ligand déterminé expérimentalement approprié. Les composés peuvent ensuite être ajoutés à cette solution mère individuellement ou en mélanges. La liaison du composé entraînera le déplacement de la sonde et la récupération subséquente du signal. Pour une série de ligands ajoutés à la même concentration, la quantité de signal récupérée sera proportionnelle à l’affinité de chaque ligand pour la protéine (Informations de support, Tableaux 1 et 2). La sensibilité de cette méthode en tant qu’outil de dépistage peut être ajustée de deux manières, soit en faisant varier la concentration de ligands potentiellement concurrents, soit en faisant varier la concentration de la protéine cible. Des concentrations de ligand plus élevées peuvent être utilisées pour augmenter la sensibilité de la méthode de criblage de fragments faiblement liants, tandis que des concentrations plus faibles peuvent être utilisées pour augmenter la sélectivité de la méthode. De manière analogue, la sensibilité / sélectivité de la méthode peut être ajustée en faisant varier la quantité de protéine cible. L’ajout de protéines au-delà de la quantité nécessaire pour observer l’élargissement maximal augmentera la sélectivité de la méthode car la protéine supplémentaire agira comme un “ sink ” En plus de la conformation de liaison simple, cette méthode pourrait être utilisée pour obtenir rapidement une estimation approximative de la valeur de KD pour un ligand donné, à condition que quelques ligands d’affinité connue et variable soient disponibles. Ces ligands connus pourraient être utilisés pour dériver une courbe d’étalonnage en traçant le pourcentage d’intensité récupérée pour chaque ligand vis-à-vis de son affinité. Les valeurs d’intensité retrouvées pour les ligands d’affinité inconnue pourraient alors être estimées à partir de cette courbe. Nous avons développé une nouvelle méthode basée sur le ligand pour le criblage RMN que nous avons appelée LLD car elle est basée sur le déplacement d’une molécule sonde marquée au carbone 13 une cible protéique. C’est une méthode très simple à appliquer et présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de criblage à base de protéines telles que “ SAR par RMN ” ainsi que d’autres méthodes à base de ligand telles que STD. Par rapport aux méthodes à base de protéines, LLD peut être appliqué à n’importe quelle protéine de taille, et en fait, l’effet d’élargissement sur lequel la méthode est basée devrait être amélioré pour les protéines plus grandes. Alors que les quantités de protéines nécessaires sont à peu près les mêmes que pour les méthodes à base de protéines, la protéine isotopiquement marquée n’est pas nécessaire, et ainsi, des protéines provenant d’autres sources que Escherichia coli recombinantes cultivées dans des milieux minimaux peuvent être utilisées. Par rapport aux méthodes STD, LLD permet de filtrer les signaux des ligands concurrents, ce qui est particulièrement avantageux pour le criblage des mélanges. En plus de l’utilité de la LLD pour le criblage traditionnel de petites molécules ou de fragments, elle pourrait aussi, en principe, être utilisée comme test orthogonal pour essentiellement toute protéine cible soluble.