Détection fréquente des virus respiratoires chez les adultes recevant des greffes de cellules souches à l’aide d’une réaction en chaîne de la polymérase en temps réel, comparée à la culture virale

Contexte Les infections respiratoires virales ont été reconnues comme des causes importantes de pneumonie sévère chez les patients ayant subi une greffe de cellules souches SCT Les incidences signalées d’infection virale respiratoire chez les adultes SCT varient dans la littérature de% à% lorsque déterminé par la culture virale. la méthode d’évaluation de la présence de virus respiratoires dans les voies respiratoires inférieures peut être importante pour la délimitation de l’incidence réelle de la pneumonie respiratoire virale et peut être essentielle pour guider la mise en œuvre d’un traitement antiviral et prévenir ou limiter la propagation nosocomiale des virus respiratoires. Pour déterminer l’incidence et la sévérité des maladies respiratoires et évaluer la valeur diagnostique de la RT-PCR en temps réel par rapport à la culture virale, les receveurs de SCT ont été suivis pendant une période de un mois. Résultats Un virus respiratoire a été détecté en% des épisodes de RTI par le cul viral ture et en% des épisodes d’ITR par RT-PCR en temps réel P & lt; Dans les maladies des voies respiratoires inférieures, la RT-PCR en temps réel était beaucoup plus sensible que la culture virale pour la détection du virus respiratoire% vs%; P = Le taux de mortalité des patients souffrant de maladies des voies respiratoires inférieures associées au virus respiratoire% était similaire aux taux rapportés ailleurs Les virus respiratoires à prédominance de rhinovirus ont été détectés par RT-PCR en temps réel en% des échantillons obtenus à des périodes prédéterminées. par RT-PCR en temps réel et par culture virale en% P & lt; , indiquant que l’excrétion asymptomatique des virus respiratoires se produit également. Conclusion Nous concluons que, bien que l’excrétion asymptomatique du virus respiratoire se produise, les virus respiratoires sont des causes fréquentes d’ITR chez les receveurs de TCS.

La pneumonie est l’une des complications infectieuses les plus courantes de la greffe de cellules souches SCT Au cours de la dernière décennie, les infections par virus respiratoires ont été reconnues comme des causes importantes de pneumonie sévère chez les patients ayant subi une SCT. Les PIV ont été particulièrement associées à des infections sévères des voies respiratoires inférieures après SCT, entraînant une morbidité et une mortalité élevées Cependant, le rôle des autres virus respiratoires n’a pas encore été suffisamment élucidé. Si une infection par le virus respiratoire prédispose les patients à des infections supplémentaires Une méthode sensible pour évaluer la présence de virus respiratoires dans les voies respiratoires inférieures peut être importante pour déterminer l’incidence réelle de la pneumonie respiratoire associée au virus. méthode pour la détection de v respiratoire les iris peuvent être essentiels pour guider la mise en œuvre du traitement avec les agents antiviraux actuels et pour prévenir ou limiter la propagation nosocomiale de l’infection par les virus respiratoires La RT-PCR en temps réel est une méthode extrêmement spécifique, sensible et rapide. Dans une étude rétrospective antérieure, nous avons démontré que la PCR nichée était beaucoup plus sensible que la culture virale et les tests antigéniques pour la détection des virus respiratoires chez les adultes atteints de cancer hématologique et de pneumonie [ Par conséquent, pour déterminer l’incidence et la gravité des infections virales respiratoires après la transplantation et pour évaluer la valeur diagnostique de la RT-PCR en temps réel pour la détection des virus respiratoires par rapport à la culture virale, nous avons mené une étude prospective. SCT allogénique

Patients, matériaux et méthodes

Les patients

Une étude prospective monocentrique a été réalisée d’octobre à avril après approbation du comité d’éthique local. Le consentement éclairé écrit de tous les patients participants ayant subi un SCT allogénique ou autologue a été suivi pour les infections virales respiratoires dues au virus de la grippe A ou B, RSV A ou B, PIV -, rhinovirus, entérovirus, coronavirus humains OC et E, ou adénovirus dans les mois suivant la transplantation Si des patients ont souffert d’une maladie respiratoire, un prélèvement combiné de temps RT-PCR pour la détection des virus respiratoires Des échantillons de prélèvement nasal ont également été obtenus, si possible, les jours -, -, – et – après la plainte initiale Les échantillons prélevés lors d’un épisode de maladie respiratoire ont été définis comme «échantillons diagnostiques». “En outre, des échantillons de prélèvements naso-pharyngiens ont été obtenus au moment de l’hospitalisation et les semaines, nsplantation pour surveiller l’excrétion asymptomatique des virus respiratoires et pour établir la valeur diagnostique de la détection par RT-PCR en temps réel; Ces procédures de diagnostic, telles que la radiographie, CT du thorax, et la bronchoscopie avec lavage bronchoalvéolaire BAL, ont été effectuées sur la base du jugement du médecin traitant

Régimes de conditionnement et procédures de transplantation

SCT autologues Les patients qui ont subi un SCT autologue pour leucémie aiguë ont reçu des schémas de conditionnement soit avec cyclophosphamide suivie par Gy d’irradiation corporelle totale ou avec busulphan oral et cyclophosphamide Les receveurs de SCT autologues qui ont été traités pour un lymphome ou un myélome multiple ont reçu le schéma préparatoire BEAM, -bis- -chloroéthyl-nitrosourée [BCNU], étoposide, cytarabine et melphalan ou melphalan à haute dose, respectivement. Les patients SCT allogéniques ont été traités par cyclophosphamide mg / kg iv qd pendant plusieurs jours, suivis de deux doses d’irradiation corporelle totale. Patients ayant subi un traitement allogénique volontaire SCT avec un donneur non apparenté a également reçu de la globuline antithymocyte mg / kg iv qd pendant les jours précédant le début du traitement par cyclophosphamide. Tous les receveurs de transplantation ont reçu une moelle osseuse partielle appauvrie en cellules T – × cellules T / kg

Prophylaxie de l’infection et mesures de prévention des infections

Pendant l’hospitalisation, des échantillons de surveillance d’oropharynx, d’excréments et d’urine ont été obtenus au moins une fois par semaine. La prophylaxie antibactérienne comprenait la ciprofloxacine par voie orale et l’amphotéricine B par voie orale et le fluconazole par mg qd Pour prévenir la bactériémie due aux streptocoques α-hémolytiques, les patients recevaient céphalothine iv fois par jour après la transplantation Le régime antimicrobien a été poursuivi jusqu’à ce que la numération des granulocytes soit & gt; × Les cellules qui ont subi SCT allogénique ont régulièrement reçu valaciclovir mg bid et cotrimoxazole mg qd pendant les premiers mois après la transplantation Les personnes qui ont subi un SCT allogénique qui ont eu des résultats positifs au test de cytomégalovirus pp pendant les premiers mois après SCT a reçu un traitement préventif avec ganciclovir Hospitalisé patients convalescents dans une seule pièce avec entrée gratuite pour le personnel et les visiteurs Le lavage soigné des mains et l’utilisation d’aliments microbiens à faible nombre d’agents étaient les seules mesures préventives utilisées pour ces patients

Définitions de la maladie du tractus respiratoire

Une maladie des voies respiratoires était considérée comme acquise à l’hôpital si les symptômes se développaient ⩾ jours après l’hospitalisation. L’IRTI était définie par des symptômes cliniques comme rhinorrhée, pharyngite, laryngite ou toux sans signe clinique ou radiologique d’atteinte des voies respiratoires inférieures et / ou hypoxémie LRTI a été définie par le développement d’anomalies pulmonaires radiographiques chez les patients présentant des signes et symptômes tels que la toux, la dyspnée, la production d’expectorations et la fièvre infection simultanée avec ⩾ différents virus a été considéré comme un seul épisode d’infection

Méthodes diagnostiques pour la détection systématique des agents pathogènes viraux respiratoires

Les échantillons de liquide de BAL et les écouvillons naso-pharyngés ont été placés dans un tube contenant le milieu de transport du virus, transportés directement au laboratoire et traités directement ou entreposés à ° C pendant h Les échantillons de nez-gorge et de liquide BAL ont été vortexés La partie du surnageant a été utilisée pour la culture virale conventionnelle et la culture en flacon pour la détection des virus respiratoires à savoir les adénovirus, PIV, RSV, les virus grippaux et les picornavirus Le matériau restant a été stocké à – ° C jusqu’à ce qu’une analyse plus poussée par RT-PCR en temps réel BAL échantillons liquides ont également été traitées pour les cultures bactériennes, mycobactériennes et fongiques de routine et pour l’examen des herpesvirus

Extraction d’ARN viral, synthèse d’ADNc et PCR en temps réel

L’acide nucléique total a été extrait de μL d’échantillons de liquide BAL ou de prélèvements naso-pharyngés du patient selon la méthode de Boom et al en utilisant le kit d’acide nucléique Total MagnaPure Roche Diagnostics L’acide nucléique total a été directement utilisé pour l’amplification L’ADNc a ensuite été utilisé dans différentes RT-PCR en temps réel pour la détection des virus grippaux A et B, des virus PIV, des rhinovirus, des virus de l’adénovirus et de l’ADNc. Les entérovirus, RSV A et B, et les coronavirus humains OC et EAll des amorces et sondes ont été sélectionnés à partir de GenBank et étaient basés sur des régions génomiques de haute conservation: le gène matriciel était utilisé pour le virus influenza A, le gène hémagglutinine était utilisé pour la grippe B virus , la région non-codante a été utilisée pour les Picornavirus , le gène N a été utilisé pour RSV A et B et les coronavirus E et OC , le gène hémagglutinine-neuraminidase glycoprotéine a été utilisé pour P IV -, et le gène hexon a été utilisé pour les adénovirus Les concentrations d’amorce et de sonde ont été optimisées et la PCR Taqman en temps réel a été réalisée comme décrit ailleurs Pour contrôler l’isolement et l’amplification, tous les échantillons ont été dopés virus de contrôle virus encéphalomyocardite murine [virus à ARN] et virus de l’herpès phociné [virus à ADN] Les sondes fluorogènes reconnaissant les virus respiratoires humains ont toutes été marquées avec le colorant reporter FAM et un colorant quencher TAMRA, tandis que les sondes fluorogènes reconnaissant les virus témoins ont tous été marqués avec le colorant rapporteur VIC En utilisant ces différents marqueurs fluorogènes, l’amplification d’un virus respiratoire humain peut être distinguée de l’amplification du virus du contrôle interne.

Analyses statistiques

Les statistiques descriptives ont été exprimées en valeurs médianes χ Une analyse avec l’utilisation du test exact de McNemar ou de Fisher a été effectuée pour déterminer le degré de signification entre les diverses variables

Résultats

Quatre-vingt-deux procédures SCT ont été effectuées sur les patients Neuf patients ont été exclus de l’étude les patients ont refusé la participation, et les patients ont subi un suivi après la transplantation ailleurs Les patients restants ont eu un suivi complet après SCT pendant des mois ou & lt; mois en cas de décès précoce Les caractéristiques du patient sont indiquées dans le tableau

Récipiendaires du SCTCaractéristiques de la greffe de cellules souchesConcepteurs du SCTLes données sur les épisodes de maladie respiratoire chez les patients étaient évaluables pour la détection d’un virus respiratoire. Aucun spécimen de prélèvements naso-pharyngés n’a été obtenu pendant les épisodes. des maladies des voies respiratoires avec ou sans virus respiratoire est indiqué dans le tableau

Tableau View largeTélécharger slideComparaison entre épisodes de maladies des voies respiratoires avec ou sans virus respiratoire détectable présentTable Voir grandTélécharger slideComparaison entre épisodes de maladies des voies respiratoires avec ou sans présence d’un virus respiratoire détectableDétection de virus respiratoires lors d’épisodes de maladie respiratoire Des échantillons de frottis et des échantillons de liquide de BAL ont été obtenus lors des épisodes d’infection des voies respiratoires cataplasme. En utilisant la culture virale conventionnelle, un virus respiratoire a été isolé dans le tableau% d’épisodes, par rapport au% d’épisodes. ; Les échantillons positifs à la PCR comprenaient tous les échantillons positifs pour la culture Les virus respiratoires les plus fréquemment détectés étaient les rhinovirus [%] des épisodes Les adénovirus et les coronavirus n’étaient détectés que par RT-PCR en temps réel. table des modalités SCT différentes

Tableau View largeTélécharger les lamesLes virus respiratoires sont détectés soit par culture virale, soit par RT-PCR en temps réel dans les épisodes de maladies respiratoires RTITable View largeTélécharger les virusRespiratoire détecté par culture virale ou par RT-PCR en temps réel dans les épisodes de maladies respiratoires.

Diapositive Différences entre les patients ayant reçu des greffes de cellules souches allogéniques provenant d’un donneur frère, ceux qui ont reçu des SCT provenant d’un donneur volontaire non apparenté et ceux qui ont reçu des SCT autologuesTifférences entre patients ayant reçu des greffes de cellules souches allogéniques donneur de fratrie, ceux qui ont reçu des SCT d’un donneur volontaire non apparenté VUD, et ceux qui ont reçu des SCT autologues. Quarante et un pour cent des épisodes de maladie respiratoire étaient des infections urinaires. Vingt-cinq de ces épisodes ont été associés à un virus respiratoire. par RT-PCR en temps réel, comparé aux seuls épisodes de culture virale P & lt; Le rhinovirus était le virus respiratoire prédominant dans l’IRTI% Aucun patient n’avait de progression vers un LRTI après l’IRTI et tous les patients se sont complètement rétablis sans traitement antiviralLRTI Onze% des épisodes de maladie respiratoire étaient des LTRIs Tous les patients avec un LRTI ont été admis La fièvre, la toux, la dyspnée et le malaise étaient les signes et les symptômes prédominants chez ces patients, et les cas n’avaient pas été précédés cliniquement par une URTI. Dans les épisodes, une bronchoscopie avec BAL a été réalisée et des épisodes obtenu Un virus respiratoire a été détecté par culture virale pour un épisode de LRTI et par RT-PCR en temps réel pour% d’épisodes P =; tableau, en utilisant soit des échantillons de liquide BAL n =, des échantillons combinés de prélèvements naso-pharyngiens n =; n = Un échantillon de liquide de LBA contenait des virus respiratoires: rhinovirus et parainfluenzavirus Chez les patients testés négatifs pour un virus respiratoire, une biopsie bronchoscopique a révélé d’autres causes de LRTI: pneumonie d’irradiation, aspergillose invasive, et bronchiolite oblitérante Quatre patients avec un LRTI sont décédés d’une aspergillose invasive, un patient rhinovirus positif avec une maladie lymphoproliférative posttransplantation et des patients chez lesquels seul un virus respiratoire a été détecté [coronavirus pour un patient et RSV pour l’autre]. Ces patients étaient les seuls à avoir été traités avec de la ribavirine en aérosol.Durée de détection virale dans des épisodes de maladie respiratoire Des échantillons de suivi du nez et de la gorge ont été obtenus au cours d’épisodes. de la maladie des voies respiratoires [%] des épisodes d’UR TI et [%] des épisodes de LRTI La PCR en temps réel a détecté des virus respiratoires sur une période plus longue que la culture virale. Le virus respiratoire initial a pu être détecté par RT-PCR en temps réel pour% des échantillons obtenus après apparition de symptômes, mais elle n’a pu être détectée dans aucun des échantillons par culture virale P ⩽ Le rhinovirus était le virus prédominant [%] des échantillons, suivi des échantillons de coronavirus, des échantillons RSV et des échantillons d’entérovirus Détection des virus respiratoires en l’absence de voies respiratoires Maladie Un total de spécimens de surveillance du nez et de la gorge a été prélevé sur les patients. Par culture virale, les échantillons ont été testés positifs pour les virus respiratoires, mais par RT-PCR en temps réel, un virus respiratoire a pu être détecté dans les échantillons P & lt; Le rhinovirus était l’agent pathogène prédominant dans ces échantillons de surveillance, mais des échantillons de coronavirus et d’adénovirus ont également été détectés Des échantillons de prélèvements naso-pharyngés prélevés avant la SCT ont révélé un virus respiratoire chez les patients rhinovirus; coronavirus, patient; Aucun de ces patients n’a présenté de troubles respiratoires au moment de la collecte. Trois de ces patients ont développé une URTI due au virus du rhinovirus initialement détecté ⩽ mois après la collecte initiale. L’excrétion asymptomatique prolongée du rhinovirus a été observée chez d’autres patients pendant des mois et pendant des mois. L’autre

Vue de la table grandDownload slideFindings pour les échantillons de nez-gorge de surveillance analysés avec la culture virale et RT-PCR en temps réel dans une étude de la maladie respiratoireTable View largeTélécharger le slideFindings pour la surveillance des échantillons de nez-gorge analysés avec la culture virale et RT-PCR en temps réel dans un étude de la maladie des voies respiratoires

Discussion

de patients immunodéprimés avec des maladies des voies respiratoires associées au virus respiratoire [,,,,], alors que dans la littérature antérieure, un taux de mortalité de% -% a été rapporté [,,] Les résultats négatifs dans la détection des Les prélèvements de liquide de gorge et de BAL par culture virale, comparés à la RT-PCR en temps réel, peuvent être dus à plusieurs raisons. Les méthodes d’échantillonnage utilisées avec des prélèvements naso-pharyngés combinés au lieu de prélèvements nasaux peuvent avoir influencé les résultats de la culture virale. pour la détection du VRS Tous les bénéficiaires du SCT dans notre étude étaient des adultes, qui sont généralement considérés comme ayant moins de virus que les enfants, ce qui peut réduire les taux de détection du virus respiratoire par la culture virale ou des tests diagnostiques rapides, comme la détection directe d’antigènes En outre, certains virus, tels que les coronavirus, sont difficiles à cultiver dans un laboratoire de routine Les rhinovirus ont été identifiés à la fois par culture virale et par RT-PCR en temps réel. Ce résultat n’est pas surprenant, car chez les adultes immunocompétents, les rhinovirus représentent% -% des épisodes moyens du rhume par an, et ils sont fréquents chez les adultes immunocompétents. Les rhinovirus ont été décrits auparavant comme des pathogènes responsables du LRTI chez les patients immunodéprimés [,,], soit en tant que pathogène unique ou en tant que copathogène avec des bactéries ou d’autres virus respiratoires, bien que Des études prospectives portant sur l’incidence des infections virales respiratoires chez les patients atteints de cancer hématologique ont montré une absence ou un très faible nombre d’infections à rhinovirus dans les cas d’IRTI et de LRTI Une détection rapide des infections à rhinovirus pourrait être importante. LRTI, car il a été suggéré que le médicament antiviral pleconaril pourrait être efficace pour le traitement du picornavirus sévère dans L’intérêt est le nombre de coronavirus humains détectés par RT-PCR en temps réel Les types de coronavirus humains E et OC sont les principales causes du rhume, mais ils sont notoirement difficiles à détecter. Ces virus, cependant, peuvent parfois causer une pneumonie chez les patients immunocompétents et immunodéprimés [,,] Nous avons trouvé que le coronavirus était la cause probable de la maladie en% des épisodes de maladies respiratoires L’année dernière, un nouveau coronavirus humain a été découvert. le pathogène responsable d’une épidémie de syndrome respiratoire aigu sévère, et récemment, un autre nouveau coronavirus a été décrit en association avec LRTI Ces résultats soulignent le potentiel des coronavirus comme cause de LRTIAdenovirus a été détecté dans seulement des échantillons de surveillance ou des échantillons de suivi Aucune maladie des voies respiratoires due à l’adénovirus n’a été détectée dans notre population étudiée. Les adénovirus ont été reconnus comme des voies sérieuses ogens chez les enfants SCT , mais ces virus peuvent également constituer une menace pour les adultes SCT On pense que la plupart des infections adénovirales chez les patients SCT sont causées par la réactivation de l’infection, mais l’adénovirus peut aussi causer une maladie aiguë des voies respiratoires. Bien que nous nous sommes particulièrement intéressés aux adénovirus récemment obtenus dans l’environnement et qui ont provoqué des maladies respiratoires aiguës, il est impossible de déterminer si les échantillons prélevés dans les voies respiratoires des sujets SCT révèlent une infection adénovirale récemment reconduite ou une infection réactivée à latentes. Les adénovirus du tissu lymphoépithélial du nasopharynx permettent d’établir la valeur diagnostique de la RT-PCR en temps réel. Nous avons également analysé des échantillons de prélèvements naso-pharyngés obtenus pendant les périodes où les patients SCT ne se plaignaient pas d’échantillons de surveillance des maladies respiratoires. RT-PCR, nous avons trouvé des virus respiratoires dans% de ces échantillons, dont h% étaient des rhinovirus Une étude cas-témoins récente sur des infections respiratoires aiguës chez des patients en pratique générale aux Pays-Bas a montré que l’incidence du rhinovirus chez les sujets témoins sains était de% Ces résultats montrent que les rhinovirus peuvent être excrétés par des immunodéprimés patients et des personnes en bonne santé sur une période plus longue, mais aussi que l’interprétation de la valeur de la PCR pour la détection des rhinovirus peut être compliquée. En résumé, la présente étude a montré que les virus respiratoires sont une cause majeure de maladies respiratoires chez les Nous avons démontré que RT-PCR en temps réel est beaucoup plus sensible que la culture virale pour la détection de l’infection virale respiratoire chez les receveurs SCT, ainsi que dans les cas de LRTI Rhinovirus a causé la majorité des URTIs, mais il faut savoir que les rhinovirus peuvent aussi être détecté occasionnellement chez des patients asymptomatiques, suggérant que l’excrétion persistante de virus respiratoires peut se produire dans l’immunocompromis patients ed

Remerciements

Nous sommes redevables aux gestionnaires de données Margot Gerrits et Loes Metselaar pour leur soutien. Soutien financier ICN Pharmaceuticals Holland Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: no conflicts