Découverte d’un nouvel humain Agoniste du récepteur de l’adénosine A2A, 2-Hexynyl-4 ′ -thioadénosine tronquée

L’adénosine modulateur endogène cytoprotecteur (1) exerce ses effets pharmacologiques contre l’hypoxie, l’ischémie et l’inflammation en se liant à quatre sous-types (A1, A2A, A2B et A3) des récepteurs de l’adénosine (AR), membres de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Parmi ceux-ci, on sait que l’activation de A2A AR joue un rôle dans la suppression des réponses immunitaires et inflammatoires et dans les réponses vasculaires. Il est également très localisé dans le système nerveux central (SNC), et les antagonistes sélectifs sont devenus une cible attrayante pour le traitement de la maladie de Parkinson.5 Le RA A3 est le sous-type le plus récemment identifié et est L’activation de A3 AR est bénéfique dans les modèles d’ischémie myocardique et cérébrale et de cancer, tandis que son antagonisme est intéressant pour le traitement de l’asthme, de l’inflammation et du glaucome. .8Thio-Cl-IB-MECA (2), 9,10 qui est bioisostérique avec le 2-chloro-N6- (3-iodobenzyl) adénosine-5 ′ -N-méthyluronamide (Cl-IB-MECA), 11 était découvert comme un agoniste A3 AR puissant et sélectif (Ki = 0,38 nM). Ce composé a montré une activité anticancéreuse puissante en inhibant la voie de signalisation Wnt12. Sur la base d’un plan rationnel, le dérivé 4-tricyclo-3-adiénosine dépourvu du 5-uronamide de 2 essentiel pour l’activation du récepteur a été découvert en tant que antagoniste A3 AR puissant, sélectif et indépendant de l’espèce (Ki = 1,66 nM) .13,14 Ce composé et d’autres antagonistes A3 AR associés aux squelettes nucléosidiques devraient convenir à l’évaluation dans de petits modèles animaux et à un développement ultérieur en tant que médicaments ( Figure 1: Justification de la conception des agonistes A2A AR. Sur la base de l’observation que la troncature entraînant le dérivé antagoniste de 4 ′ -thioadenosine 3 conservait l’affinité et la sélectivité AR, nous avons conçu et synthétisé dérivés de 4 ′ -thioadénosine 4a &#x02212 tronqués en C2- et C8 en tant que nouveaux ligands potentiels pour l’AR A2A Cette attente était étayée par des rapports selon lesquels la substitution C2- ou C8 des annonces pour une amélioration substantielle de l’affinité ou de la sélectivité de liaison au niveau de A2A AR ou d’un autre sous-type AR.15 et C2 ont été facilement obtenues par des réactions de couplage croisé Sonogashira18 et Suzuki19. A partir de cette étude, un dérivé C2-alcynyle s’est avéré puissant, un agoniste A2A AR mixte et un antagoniste A3 AR, ce qui constitue une excellente combinaison pour l’activité antiasthmatique. Dans la présente, nous décrivons la synthèse et l’activité pharmacologique de nouveaux dérivés de 4+ et thioadénosine substitués en C2- et C8 4a & dxn2212; d à partir de d-mannose.d-Mannose a été converti en donneur de glycosyle 5 selon notre procédure précédemment publiée. 13,14 Le donneur de glycosyle 5 a été condensé avec de la 2-amino-6-chloropurine en présence de TMSOTf en tant qu’acide de Lewis pour donner l’anomère 6 (30%) en tant que stéréoisomère unique (Schéma 1). L’assignation anomérique a été facilement réalisée dans une expérience de RMN 1H qui a montré un effet nucléaire Overhauser entre H-8 et 3 ′ -H. Le traitement du dérivé 2-amino-6-chloro 6 avec du nitrite d’isoamyle, de l’iode et de l’iodure de méthylène en présence de CuI a donné le dérivé 2-iodo-6-chloro 7 qui a été converti en dérivé 2-iodo-6-amino 8 après traitement avec de l’ammoniac méthanolique. Une réaction de couplage Sonogashira18 de 8 avec du 1-hexyne en présence de dichlorure de bis (triphénylphosphine) palladium a donné le dérivé 2-hexynyle 9.Finalement, l’élimination de l’isopropylidène de 9 avec du HCl 1 N a produit le dérivé de 2-hexynyl-4 ′ -thioadenosine final 4a. La réaction de couplage Suzuki19 du dérivé 2-iodo 8 avec le (E) -1-catécholboranylhexène 20 préparé par traitement avec du 1-hexyne et du catécholborane, en présence de tétrakis (triphénylphosphine) palladium (0) a donné le dérivé 2-hexényle 10. L’élimination de l’acétonide de 10 avec HCl 1 N a donné le dérivé 2-hexényl-4 ′ -thioadenosine 4b.Schéma 1Synthèse des dérivés 2a et 4b substitués en utilisant une stratégie similaire au schéma 1, dérivés d’adénosine 8-substitués 4c et 4d ont été synthétisés à partir du donneur de glycosyle 5 (Schéma 2). La condensation de 5 avec la 8-bromoadénine21 dans des conditions acides de Lewis a donné le dérivé 8-bromo 11. Le couplage de 11 avec 1-hexyne dans les conditions de Sonogashira a donné le dérivé 8-hexynyle 12 qui a été traité avec HCl 1N pour donner le 8-hexynyl final. -4 ′ -thioadenosine dérivé 4c.Scheme 2Synthèse des dérivés 8-substitués 4c et 4dLe dérivé 8-bromo 11 a été condensé avec (E) -1-catecholboranylhexene20 dans des conditions de Suzuki19 pour donner le dérivé 2-hexénylé 13. Le groupe isopropylidène de 13 dans des conditions acides a donné le dérivé final de 8-hexényl-4-adio- nio-adionine 4d. Des dosages de liaison ont été réalisés en utilisant des radioligands standards et des préparations membranaires de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) exprimant ) A1 ou A3 AR ou des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293) exprimant la AR222 &#H2222; 25 A la différence du composé 3 substitué N6 parent seulement faiblement lié à l’AR A2A, les variations C2-substituées du composé 3 ont conduit à une augmentation spectaculaire de l’affinité de liaison (Ki = 7,19 ± 0,6 nM pour 4a et 72,0 ± 19,1 nM pour 4b) à l’AR de hA2A, tout en conservant une affinité de liaison élevée (Ki = 11,8 ± 1,3 nM pour 4a et 13,2 ± 0,8 nM pour 4b) au hA3 AR (Tableau 1). Affinités de liaison 1Tableau de l’antagoniste A3 AR connu 3 et des dérivés 4 ′ -Thioadénosine 4a et # x02212 tronqués tronqués 4a − d à trois sous-types de hARsCes résultats indiquent que des poches hydrophobes volumineuses existent dans les sites de liaison de A2A AR et A3 AR, permettant le substituant C2 pour former des interactions hydrophobes favorables. Le dérivé 2-alcynyle 4a présentait une meilleure affinité de liaison que le dérivé 2-alcényle 4b. De manière intéressante, la substitution C8 sur 3 a aboli l’affinité de liaison au hA2A AR, mais l’affinité de liaison au hA3 AR a été maintenue bien que diminuée. Ces découvertes suggèrent qu’un groupe hydrophobe encombrant en position 8 pourrait être toléré au site de liaison de la hA3 mais pas à la hA2A AR. La capacité à améliorer l’affinité au niveau de l’A2A AR dans la série tronquée en étendant une chaîne carbonée insaturée à la position 2 implique un mode de liaison au récepteur en commun avec la série des ribosides.15 − 17 Tous les composés ont montré une affinité de liaison très faible à les composés ARA hA1 4a et 4b se sont avérés être des antagonistes puissants et complets dans un essai fonctionnel d’AMP cyclique au niveau de l’AR hA3. Dans ce test, la dose 4a a décalé de manière dépendante la courbe de réponse de concentration pour l’agoniste Cl-IB-MECA vers la droite en tant qu’antagoniste, correspondant à une valeur de KB de 1,69 nM calculée par l’analyse de Schild (Figure 2). .2). Ceci est cohérent avec les études précédentes dans lesquelles les dérivés de 4-substitués en N6 tronqués ont généralement présenté une activité antagoniste de A3 AR.13,14 Cependant, dans un essai fonctionnel d’AMP cyclique au niveau de l’AR de hA2A exprimé dans des cellules CHO, le composé 4a s’est comporté. en tant qu’agoniste complet par rapport au standard 2- [p- (2-carboxyéthyl) phényl-éthylamino] -5 ′ -N-éthylcarboxamidoadénosine ({“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {” text “:” CGS21680 “,” term_id “:” 878113053 “,” term_text “:” CGS21680 “}} CGS21680) et affiche un EC50 de 12 nM. Au niveau de l’AR hA2B exprimé dans les cellules CHO, 4a était un agoniste partiel faible dans l’accumulation d’AMP cyclique (EC50 ∼ 10 μ M). La découverte que le composé 4a est à la fois un agoniste puissant et un agoniste sélectif de l’AR de hA2A et un antagoniste compétitif de l’AR de hA3 est similaire au profil pharmacologique d’un dérivé d’adénosine plus fortement substitué en position 2,5, qui inhibait à la fois formation d’espèces réactives de l’oxygène et éosinophiles dégranulation pour l’activité antiasthmatique.Figure 2Déplacements droite droite induite par le composé 4a sur la courbe de réponse de concentration d’un agoniste complet dans l’inhibition de la production d’AMP cyclique au hA3 AR exprimé dans les cellules CHO (A ), le diagramme de Schild correspondant (B), et l’activité de 4a comme … Pour étudier le mode de liaison, nous avons effectué une étude de l’amarrage des dérivés de 4 ′ -thioadenosine substitués en C2- et C8 4a − d dans la structure cristallographique des rayons X hA2A AR (code PDB: 3EML) 27 en utilisant le logiciel GOLD, 28 en considérant la flexibilité des résidus du site de liaison.Comme montré sur la figure &#x200B, la figure 3, 3, les dérivés de 4 ′ -thioadenosine substitués en C2 4a et 4b, dont les affinités de liaison sont dans la plage nanomolaire, occupaient très bien le site de liaison. Leurs substituants C2 volumineux et rigides sont orientés vers la région extracellulaire, formant des interactions hydrophobes. Les fragments d’adénine semblaient former trois liaisons H avec Glu169 et Asn253, et les systèmes cycliques étaient dans π − π empiler avec Phe168. De plus, les anneaux de thio-sucre étaient situés profondément à l’intérieur de la poche de liaison, et les groupes -OH étaient capables de donner une liaison H à Ser277. Sur la base de ce résultat, on s’attendait à ce que les substituants en C8 soient orientés dans une poche hydrophobe profondément à l’intérieur du site de liaison, qui n’était pas occupée par 4a et 4b sur la figure 3.3. Cependant, les dérivés substitués en C8 4c et 4d présentaient divers modes de liaison (données non présentées). En plus du mode de liaison attendu, les substituants en C8 pointent alternativement vers la région extracellulaire par une rotation de la liaison entre l’adénine et les cycles thio-sucre. Cela pourrait être dû à une restriction spatiale des substituants C8 longs et rigides dans la poche hydrophobe à l’intérieur du site de liaison, ce qui entraînerait une perte de liaison H par les nucléosides et / ou # x003c0; − π interactions d’empilement qui ont été montrées pour les dérivés substitués en C2. Ces résultats pourraient expliquer pourquoi les affinités A2A AR de 4c et 4d ont été réduites.Figure 3 Modes de liaison prédits de (A) 4a et (B) 4b ancrés dans la structure cristalline AR hA2A. Les résidus interagissant clés sont marqués et affichés en bâton bouché, à l’exception de Phe168 en boule-et-bâton, avec des atomes de carbone en blanc. Les ligands sont représentés sous forme de billes et de bâtons … En conclusion, nous avons synthétisé les dérivés de 4 ′ -thioadénosine 4a et C8 tronqués 4a & dd; à partir de d-mannose, en utilisant une croix catalysée par du palladium. les réactions de couplage en tant qu’étapes clés. Bien que l’activité antagoniste de divers thionucléosides tronqués au A3 AR ait été bien exploré précédemment, il s’agit de la première caractérisation de l’activité fonctionnelle de tels dérivés au niveau de l’AR A2A. A partir de cette étude, nous avons identifié avec succès des agonistes A2A AR puissants et stériquement compacts, 4a et 4b, en plaçant des groupes 2-hexynyle ou 2-hexényle hydrophobes étendus sur des dérivés de 4′-thioadénosine tronqués et N6 non substitués. Cette observation a été soutenue par la modélisation moléculaire qui a placé la chaîne à la position 2 dans une région hydrophobe de l’A2A AR. Cependant, la substitution C8 a grandement réduit l’affinité de liaison au hA2A AR. Ainsi, l’absence d’un 5-uronamide d’agonistes A2A AR typiques et du CH2OH natif d’adénosine n’empêchait pas une liaison puissante et une activation complète de l’AR hA2A. Ceci suggère une différence majeure entre l’AR A2A et l’AR A3 dans la voie d’activation du récepteur. Tous les composés synthétisés 4a − d ont conservé leur affinité de liaison au A3 AR humain et, comme pour les analogues 2-H ou 2-Cl qui étaient N6 substitués, l’antagonisme compétitif du A3 AR a été démontré. Cette étude établit que les dérivés 4a et 4b tronqués 4a et 4b substitués en C2 peuvent servir de nouvelle matrice pour le développement de nouveaux ligands de A2A AR, bien qu’ils puissent encore interagir au A3 AR. Cette activité mixte en tant qu’agoniste de A2A AR / antagoniste de A3 AR pourrait également être avantageuse dans des modèles de maladie tels que l’asthme.26 L’élucidation complète de la structure et de l’activité de cette série est en cours dans notre laboratoire.