Activité ostéogénique in vitro et in vivo du largazole

Le depsipeptide cyclique largazole (Figure 1A), 1A), isolé à partir d’une cyanobactérie du genre Symploca par Luesch et ses collaborateurs, est un produit naturel marin à échafaudage chimique.1 Le largazole possède une activité inhibitrice de croissance très différentielle, ciblant préférentiellement les cellules transformées sur les cellules non transformées. La structure intrigante et l’activité biologique du largazole ont suscité un vif intérêt de la part de la communauté de la chimie de synthèse pour établir des voies de synthèse vers le largazole et pour étudier son potentiel thérapeutique contre le cancer. Luesch et Hong ont rapporté la première synthèse totale de largazole, les histones déacétylases identifiées (HDAC) comme cibles moléculaires, et démontré l’activité antitumorale dans un modèle de souris xénogreffe.2,3 Suite à notre rapport initial, des synthèses totales et formelles supplémentaires, d’autres études sur son L’inhibition des HDAC et les études sur les relations d’activité de la structure sont apparues dans la littérature.4 − 17Figure 1 Le largazole présente des activités inhibitrices et ostéogéniques des HDAC dans les cellules C2C12. (A) Structure de largazole. (B) Effet du largazole sur l’activité totale HDAC dans les cellules C2C12. Cellules (4 × 103 cellules / puits) ont été cultivées dans une plaque de 96 puits pendant 24 h et … L’ostéogenèse est un processus complexe associé à des changements dramatiques dans l’expression des gènes.En raison de leur capacité à modifier la structure de la chromatine et à moduler la transcription génique, les HDAC jouent un rôle important dans l’ostéogenèse et sont considérées comme une cible thérapeutique prometteuse pour les maladies osseuses, notamment l’ostéoporose19. Plusieurs inhibiteurs d’HDAC, dont la trichostatine Le butyrate 20 et l’acide valproïque 21 ont été testés pour leur activité ostéogénique, mais aucun d’entre eux ne s’est montré efficace dans des modèles in vivo pour un développement ultérieur en tant que thérapeutiques potentielles pour les maladies liées aux os. De plus, il a été rapporté qu’un traitement à long terme par l’acide valproïque augmente l’incidence de l’ostéoporose et des fractures osseuses.22,23 Nous rapportons ici l’activité ostéogénique in vitro et in vivo et le potentiel significatif du largazole dans la formation, la réparation, Les cellules C2C12 pluripotentes précurseurs mésenchymateuses ont été utilisées comme modèle in vitro d’ostéogenèse. Les cellules C2C12 sont connues pour être impliquées dans les ostéoblastes avec l’induction de plusieurs isoformes ostéogéniques de protéines morphogénétiques osseuses (BMP) telles que BMP-2, 4, 6, 7 et 9.24. Avant d’évaluer l’activité ostéogénique du largazole, nous avons examiné l’effet de largazole sur la viabilité des cellules C2C12 et a constaté que le largazole n’a pas montré un niveau significatif de cytotoxicité jusqu’à 100 nM (voir les informations de soutien pour les détails) .Next, nous avons examiné les effets de largazole sur l’inhibition de l’activité HDAC et l’accumulation d’histones acétylées dans des cellules C2C12 pour confirmer son activité inhibitrice d’HDAC. Le largazole a diminué l’activité HDAC totale dans les cellules C2C12 (Figure 11B) 25 et a augmenté de manière significative les niveaux d’histones acétylées d’une manière dépendante de la dose (Figure 11C). L’effet du largazole sur l’engagement de cellules C2C12 dans les ostéoblastes a été déterminée par le niveau d’expression de la phosphatase alcaline (ALP), un marqueur de phase précoce de la différenciation des ostéoblastes jusqu’à 50 nM, le largazole augmentait l’expression de l’ALP d’une manière dose-dépendante (Fig. Figure1D) .1D). En outre, largazole induit significativement l’expression de l’ALP et de l’ostéopontine (OPN) au niveau des transcrits (voir les informations de support pour plus de détails) .Comme Runx2 s’est avéré critique dans l’ostéogenèse et régule l’expression osseuse gènes spécifiques tels que ALP et OPN, 26 nous avons examiné l’effet de largazole sur l’activation et l’expression de l’ARNm de Runx2 en utilisant le p6 &#x000d7, l’élément cis-spécifique des ostéoblastes 2-luciférase reporter27 et PCR en temps réel, respec tivement (Figure ​ (Figure2) .2). Par rapport au témoin DMSO, le largazole à 50 nM a augmenté de manière significative l’activité et le niveau d’ARNm de Runx2 respectivement de 29 fois et de 3 fois (Figure 2A2A et B) car les HDAC ont été identifiées comme des protéines corepressor à affectent l’activité de Runx2 28, ces résultats suggèrent que l’inhibition des HDAC par le largazole augmente l’activation de Runx2, potentialise la différenciation des ostéoblastes et augmente la formation osseuse.Figure 2Effet du largazole sur l’activation de Runx2 et l’induction de l’ARNm de Runx2 et BMPs dans les cellules C2C12. l’activation a été mesurée par un test de rapporteur de luciférase en utilisant des cellules C2C12 transfectées par le plasmide OSE2-luc. Les cellules (4 × 103 cellules / puits) … D’après les données montrant que l’expression accrue d’ALP induite par largazole a été inhibée par la noggine, un inhibiteur spécifique des BMPs (voir Figure 1D), nous avons émis l’hypothèse que l’activité ostéogénique du largazole pourrait résulter de son potentiel à augmenter l’expression des BMPs. Pour tester cette hypothèse, nous avons évalué l’effet du largazole sur les niveaux d’expression de l’ARNm des BMP (Figure ​ (Figure2B) .2B). Largazole induit significativement les expressions de BMP-2, 4, 6, 7 et 9, soutenant notre hypothèse que l’activité ostéogénique de largazole est médiée par l’augmentation de l’expression et / ou l’activité de Runx2 et BMPs. Récemment, BMP-2 et BMP-7, avec une forte activité ostéogénique, ont été approuvés pour des applications cliniques, y compris la fusion vertébrale, la guérison des fractures et l’ingénierie tissulaire dentaire29,30. Par conséquent, les agents anabolisants tels que le largazole La voie de signalisation BMP serait utile pour le traitement des maladies liées aux ostéoblastes par la formation ou la régénération osseuse31,32. En outre, nous avons trouvé que le largazole inhibe la formation d’ostéoclastes multinucléés (voir les informations de support pour plus de détails). Nous avons examiné l’activité ostéogénique in vivo du largazole en utilisant deux modèles in vivo indépendants: le test de formation de l’os calvaire de la souris et le modèle de guérison de la fracture de l’os calvaire de lapin.Dans le test de formation de l’os calvarial chez la souris, lorsque des éponges de collagène imbibées de largazole ont été implantées dans des os calvaires, le largazole a induit la formation d’os tissés sur le périoste des os calvariaux (Figure 3) .3). La formation de l’os tissé à la concentration inférieure (10 & spplus M, figure & 3B) 3B) était plus significative que celle à la concentration plus élevée (50 μ M, figure ​ figure 3C). 3C). Ces données suggèrent que le largazole peut montrer l’effet biphasique qui a été observé avec d’autres composés ostéogéniques.33 − 35 D’autres études sont nécessaires pour déterminer la dose optimale pour l’efficacité in vivo la plus élevée.Figure 3Largazole a montré une activité osseuse dans la calvaria de souris . On a placé des éponges de collagène contenant 5 μ L de véhicule PBS (A) ou largazole (B, 10 μ M; C, 50 μ M) sur des os de la calvaire de la souris. Après une implantation de 3 semaines, les souris ont été … Nous avons également évalué l’activité de formation osseuse in vivo du largazole dans le modèle de guérison de la fracture de l’os calvaire de lapin (Figure ​ Dans cette étude, le phosphate de calcium biphasique macroporeux (MBCP) a été utilisé comme échafaudage de base pour induire la formation osseuse cancer du sein. Bien qu’une formation osseuse incomplète ait été observée avec les MBCP seuls (figure 4A, figure 4A), des os nouvellement formés en contact direct avec des MBCP mélangés à du largazole ont été observés (figure 4B4B et C). est un besoin clinique significativement non satisfait de petites molécules pour améliorer les propriétés biologiques de MBCP et son ostéoconductivité, ces données montrent clairement le grand potentiel de largazole pour améliorer la propriété des substituts de greffe osseuse dans la reconstruction des défauts osseux.Figure 4Largazole présente une activité de régénération osseuse dans du calvaria de lapin, on a mélangé 10 mg de substitut de greffe osseuse, MBCP (indiqué par un astérisque noir (*), Biomatlante, France) avec 50 ° C de PBS (A) ou de largazole (B, 100 nM; C, 250 nM), et les défauts étaient … En résumé, nous avons montré que l’inhibiteur d’HDAC largazole présente une activité ostéogénique in vitro et in vivo.Largazole induit significativement l’expression d’ALP et OPN.L’activité ostéogénique de largazole a été médiée par e augmentation de l’expression de Runx2 et des BMP. Plus important encore, le largazole a montré une efficacité de formation osseuse in vivo dans le test de formation de l’os calvaire de la souris et le modèle de guérison de la fracture de l’os calvaire de lapin. La double action du largazole pour stimuler la formation osseuse et inhiber la résorption osseuse serait une caractéristique utile dans le développement de médicaments pour les troubles liés aux os. Pris ensemble, le largazole présente un grand potentiel clinique en tant que nouveau traitement pour les maladies osseuses en plus de son potentiel déjà prouvé en tant qu’agent antitumoral.3